DANNI AL GENOMA UMANO

Un articolo da una rivista che ogni tanto si ricorda i suoi trascorsi autorevoli prima che si vendesse del tutto alla Ricerca mercantile di BigFarma:

Questa breve rassegna è stata presentata qui per facilitare una discussione indipendente e più equilibrata sui potenziali rischi dovuti alla presenza di

DNA vettore di adenovirus (AstraZeneca, Johnson & Johnson, Sputnik V e altri) o SARS-CoV-2 RNA (BioNTech / Pfizer, Moderna) nei vaccini che dovrebbero proteggere dal Covid-19.
Naturalmente, le iniezioni di vaccini basati su vettori nel muscolo deltoide umano sono una questione diversa rispetto ai rari eventi casuali che portano a eventi di ricombinazione tra DNA estranei e umani nei sistemi sperimentali come descritto sopra.
Inoltre, né il tipo né la frequenza delle conseguenze di rari eventi di integrazione vettoriale possono essere valutati realisticamente al momento.
I risultati recentemente pubblicati sui benefici della protezione contro Covid-19 offerti dai vaccini BioNTech / Pfizer stanno incoraggiando Dagan et al. 2021].

Certo, la giuria è ancora fuori sul fatto che qualcuno dei vaccini proteggerà dalle nuove varianti più pericolose di SARS-CoV-2 dal Regno Unito, dal Sud Africa, dal Brasile e dalle varianti sconosciute che potrebbero sorgere in futuro dati i livelli scarsamente controllati di replicazione virale in tutto il mondo.
Infine, ignoriamo la protezione vaccinale contro lo sviluppo di sintomi prolungati e ad esordio tardivo di Covid-19.
Le informazioni presentate in questa revisione aiuteranno i futuri vaccinati a effettuare una valutazione del rischio rispetto al beneficio, vale a dire gli eventi di integrazione del vettore adenovirus o del DNA del trascritto inverso dell’RNA SARS-CoV-2 a bassa frequenza rispetto all’efficacia e alla protezione del vaccino, si spera elevata.
Inoltre, poiché l’infezione da SARS-CoV-2 da sola può essere associata all’integrazione di trascrizioni inverse dell’RNA virale [Zhang et al, 2020], questa serie di eventi potrebbe diventare inevitabile in qualsiasi infezione da SARS-CoV-2.
Infine, la misura in cui i prodotti genici adenovirali potrebbero diventare co-espressi con la glicoproteina spike SARS-CoV-2 dopo l’iniezione di vaccino vettore nei muscoli deltoidi umani rimane non studiata.
Al momento non possiamo valutare i loro possibili effetti sull’organismo umano, se effettivamente espressi.
Opportunità e rischi, entrambi allo stesso tempo, rimangono al di là delle nostre aspettative di controlli assoluti perché la vita e l’evoluzione probabilmente sono state basate su “meccanismi di casualità” fin dall’inizio.
Le osservazioni cliniche sui risultati positivi di lunga durata del test RT-PCR che implicano l’integrazione del DNA SARS-CoV-2 nel genoma umano nel corso di alcuni casi di Covid-19, rendono irrealistiche le apprensioni sugli eventi di integrazione associati al vaccino, rispetto ai benefici sperati dalla vaccinazione contro Covid-19.
La popolazione umana del 2021 affronta una crisi biomedica di dimensioni senza precedenti negli ultimi tempi e dovrà accettare le migliori contromisure disponibili contro il Covid-19 del giorno – Vaccinazione.
Vigorosi programmi di vaccinazione contro il Covid-19 che causato dalla SARS-CoV-2 sono la principale opportunità per combattere questa terribile pandemia.
I vaccini attualmente somministrati dipendono da vettori di DNA di adenovirus o da mRNA SARS-CoV-2 che potrebbero essere trascritti inversamente nel DNA, anche se raramente.
In alcune società, le persone sono diventate sensibilizzate contro i potenziali effetti collaterali a breve o lungo termine del DNA estraneo iniettato negli esseri umani.
Nel mio laboratorio, il destino del DNA estraneo nelle cellule e negli organismi dei mammiferi (umani) è stato studiato per molti anni.
In questa recensione, verrà presentato un riepilogo dei risultati ottenuti.
Questa sinossi è stata inserita nel contesto evolutivo delle inserzioni di retrotrasposoni nei genomi pre-umani milioni di anni fa.
Inoltre, saranno descritti studi sul DNA basato su vettori di adenovirus, sul destino del DNA ingerito dal cibo e sulla persistenza a lungo termine dell’RNA/DNA sars-CoV-2.
L’effettiva integrazione di molecole di DNA virale e di DNA vettore di adenovirus sarà probabilmente un evento casuale la cui frequenza e le cui conseguenze epigenetiche non possono essere valutate con certezza.
La revisione affronta anche i problemi di espressione genica adenovirale residua nei vettori a base adenovirale e il loro ruolo negli effetti collaterali dei vaccini.
Alla fine, si ridurrà a soppesare i possibili rischi di inserimenti genomici di DNA estraneo associato al vaccino e livelli sconosciuti di espressione genica adenovirale trasportata da vettori rispetto alla protezione contro i pericoli del Covid-19.
Una decisione a favore della vaccinazione contro le malattie potenzialmente letali sembra prudente.
Informare il pubblico sulle complessità della biologia sarà una guida affidabile quando si devono prendere decisioni personali sulle vaccinazioni.
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1. Contesto

Molti dei vaccini attualmente approvati contro sars-Coronavirus-2 (AstraZeneca / OxfordUniversity, Johnson & Johnson’s Janssen COVID-19Vaccine e Sputnik V) si basano su vettori di DNA di adenovirus come vettori per le informazioni genetiche per la glicoproteinaspike SARS-COV-2.

I vaccini prodotti da BioNTech/Pfizer o Moderna contengono l’RNA messaggero (mRNA) per la sintesi di questa proteina.

Dopo l’iniezione del vaccino, l’mRNA attiverà direttamente la sintesi della proteina spike virale nei vaccinati. Pertanto, l’interesse pubblico per il destino del DNA estraneo (adenovirale o SARS-CoV-2 trascritto inverso) nelle cellule e negli organismi dei mammiferi (umani) è diventato acuto e diffuso.

Le preoccupazioni delle persone sono state formulate in incontri personali occasionali come “il vaccino entra nei mieigeni“?

L’autore sostiene il concetto che il pubblico ha diritto all’intera portata dell’informazione scientifica su questi temi. Il resoconto qui presentato di precedenti lavori sperimentali sull’integrazione del DNA straniero e le sue conseguenze fornirà un utile aggiornamento su questi temi di interesse pubblico.

Questa sinossi descrive il destino del DNA estraneo nelle cellule di mammifero, la sua possibile integrazione nel genoma dell’ospite e le potenziali conseguenze per le cellule transgenomiche (Doerfler, 2000Doerfler et al., 2018).

Di fronte alla pandemia mondiale di SARS-CoV-2 ancora in espansione, queste informazioni devono essere controbilanciate rispetto ai benefici di un vettore di DNA adenovirus o di un vaccino a mRNA contro covid-19 potenzialmente letale (Malattia da Coronavirus 2019).

Non ci sono prove che gli adenovirus umani siano causalmente coinvolti nella tumorigenesi umana, ma questa possibilità non può essere categoricamente esclusa, in particolare per i vaccini basati su vettori.

Inoltre, nei tumori di criceto indotti da Ad12, la persistenza del genoma di Ad12 nelle cellule tumorali non è richiesta per il mantenimento dello stato trasformato dei tumori indotti da Ad12 (Kuhlmann et al., 1982).

Come discusso di seguito, i fattori epigenetici potrebbero svolgere un ruolo importante nella tumorigenesi dell’adenovirus e affinché il loro effetto domini, la persistenza di lunga data del transgenoma non è essenziale

(Doerfler et al., 2018Heller et al., 1995).

Le possibili sequele a lungo termine del DNA vettoriale adenovirale o dell’integrazione dell’RNA messaggero SARS-CoV-2 trascritto inversamente per la funzionalità e la sopravvivenza delle cellule transgeniche vettori non possono essere previste con certezza in singoli casi.

Tuttavia, in questa fase della pandemia di Covid-19, le nostre attività dovranno essere focalizzate sulla lotta alla pandemia con vaccini adeguati e future misure terapeutiche.

2. Background evolutivo – elementi trasponibili nel genoma umano

Quasi il 50% dei 3 × 109nucleotidi-coppia genoma umano rappresentano elementi trasponibili e l’8% costituisce genomi retrovirali endogeni.

Il significato di questo fatto genetico non è stato attivamente riflesso nella ricerca in genetica molecolare.

Apparentemente, una parte importante del genoma umano di oggi è stata inserita gradualmente durante i tempi evolutivi dall’integrazione di DNA estraneo o di DNA retro-trascritto da genomi retrovirali di RNA.

Analisi più recenti hanno rivelato che gli elementi ripetitivi potrebbero ammontare al 66%-69% del genoma umano (DeKoning et al 2011).

Le sequenze di DNA estraneo sono diventate frequentemente inattivate attraverso meccanismi epigenetici,cioè dalla metilazione del DNA estraneo e dalle strategie di metilazione degli istoni alterate. 

Si stima che questi antichi eventi di integrazione risartino a >60-70 milioni di anni fa, forse più a lungo. La loro esistenza e la loro massiccia estensione supportano l’idea che l’inserimento di DNA estraneo in genomi stabiliti sia stato facilitato da un meccanismo elementare emerso nei primi tempi evolutivi e molto probabilmente ha svolto un ruolo importante nel guidare l’evoluzione.

Ancora oggi, parti selezionate di queste antiche integrazioni possono essere trascritte e ci sono differenze interi individuali per quanto riguarda l’estensione dei loro livelli di espressione. Inoltre, gli elementi regolatori presenti negli elementi retrovirali endogeni e nei siti di riconoscimento per le interazioni DNA-proteina svolgono funzioni poco comprese.

La loro importanza per l’organismo umano può essere solo ipotizzata. Alcune parti di sequenze retro virali endogene possono diventare sovra espresse nei tumori umani e nelle malattie autoimmuni, nonché nelle infezioni virali, comprese quelle da SARS-CoV-2.

Ci sono prove che gli elementi retro virali endogeni sono deregolati durante l’invecchiamento. Una panoramica sulla biologia di queste sequenze che spesso sono state erroneamente sottovalutate come DNA spazzatura, è stata presentata di recente (Geis e Goff, 2020).

3. Sinossi delle analisi precedenti

Il lavoro su e con i vettori di adenovirus si basa sull’affermazione non provata che questi vettori sono sicuri perché il DNA dell’adenovirus “non si integrerebbe” nei genomi delle cellule riceventi. Non ci sono prove concrete per questa interpretazione.

Quindi, la seguente sinossi del nostro lavoro e di quella di altri contesta questa nozione (Doerfler et al., 1984).

I problemi incontrati nelle procedure terapeutiche geniche del passato (Samanathan et al, 2020) e attualmente con i vaccini SARS-CoV-2 basati su vettori di adenovirus richiederanno una rivalutazione approfondita degli svantaggi che i sistemi vettori di adenovirus comportano.

Naturalmente, il destino del DNA adenovirale intatto e quello del DNA vettore parzialmente difettoso è diverso per alcuni aspetti, sebbene entrambi siano soggetti agli stessi meccanismi di ricombinazione integrativa cellulare. Inoltre, le quantità di DNA vettore di adenovirus somministrate nei programmi di vaccinazione (circa 2,5 μ) sono inferiori a quelle delle procedure di terapia genica.

Si pensa che il DNA vettore dell’adenovirus raggiunga principalmente le cellule del fegato (Stephen et al, 2010) e probabilmente entri anche nelle cellule del sistema immunitario.

3.1. Genomi di adenovirus di tipo 12 nel tumore del criceto e nelle cellule trasformate

L’adenovirus umano di tipo 12 (Ad12) induce neoplasie neuroectodermiche primitive nel 70-90% dei criceti siriani appena nati inoculati dal virus, Mesocricetus auratus (Trentin et al. 1962; Hohlweg et al. 2003).

Il DNA di Ad12 nella linea cellulare T637 del tumore del criceto indotta da Ad12 è stato integrato mediante ricombinazione eterologa in 10-12 copie, spesso in un sito genomico selezionato casualmente (Fig. 1A, freccia verde, bianca).

Non vi è, tuttavia, alcuna prova che uno qualsiasi degli adenovirus umani sia implicato nella tumorigenesi umana.

Fig. 1

In 58 tumori di criceto indotti da Ad12 in modo indipendente, copie multiple di DNA virale sono state integrate in un sito di integrazione cellulare scelto a caso, sebbene le posizioni genomiche di questi siti differissero tra i singoli tumori di origine clonale.

In due ulteriori tumori, le integrazioni di DNA Ad12 sono state localizzate ciascuna in due diversi siti nel genoma delle cellule tumorali.

In ogni tumore, il DNA Ad12 integrato era diventato de novo CpG-metilato

(Hilger-Eversheim e Doerfler, 1997)

Grande enfasi nelle analisi di cellule tumorali di criceto trasformate o indotte da Adenovirus è stata posta sulla clonazione molecolare e sul sequenziamento di numerosi siti di giunzione tra dna di adenovirus integrato e DNA cellulare adiacente per accertare il legame covalente tra DNA virale e cellulare degli integrati (Deuring et al., 1981aStabel, Doerfler, 1982Gahlmann et al. 1982; (Deuring e Doerfler, 1983Doerfler et al., 1984Schulz et al., 1987).

Il meccanismo di inserimento appariva simile o identico a quello della ricombinazione non omologa.

Esistevano omologie di sequenza brevi e spesso frammentarie tra i termini del DNA dell’adenovirus e la sequenza cellulare mirata nei siti adiacenti di inserimento. In alcuni casi, la sequenza di DNA cellulare ricevente adiacente al DNA virale integrato era trascrizionalmente attiva (Schulz etal. 1987).

In uno studio pilota, la ricombinazione inserzionale tra DNA virale e cellulare è stata ricostruita in un sistema privo di cellule da estratti nucleari di criceto utilizzando una sequenza di DNA cellulare preinsertion precedentemente identificata e segmenti di DNA dell’adenovirus terminale come partner di ricombinazione (Jessberger et al. 1989).

I prodotti di ricombinazione sono stati analizzati al momento della al momento della clonazione dalla reazione e hanno mostrato caratteristiche simili a quelle delle cellule trasformate da adenovirus (Tatzelt et al. 1992).

3.2. Un sistema modello per studiare l’integrazione del DNA Ad12 in cellule di criceto infette abortivi

Il sistema tumorale Ad12-criceto è stato riconosciuto all’epoca come un potente modello per studiare le interazioni Ad12-cellula ospite.

Ad12 infetta le cellule di criceto abortito con un blocco completo di replicazione del DNA virale e una scarsità di genomi virali che raggiungono i nuclei delle cellule (Doerfler, 1969Zock e Doerfler, 1990, 1995; Hochstein et al., 2008].

Pertanto, a causa di questo blocco nella replicazione del DNA virale e nell’espressione genica tardiva, Ad12 non era in grado di replicarsi nelle cellule di criceto, il che soddisfaceva una precondizione essenziale per l’integrazione del DNA virale e la tumorigenesi.

In una serie di esperimenti modello [Doerfler, 1968, 1970], le cellule di criceto con DNA cellulare pre-etichettato con 5 bromodeoxuridina (5-BU) sono state infettate da enormi inoculi di3Virus Ad12 H-timidina-DNA-labeled.

Con la centrifugazionealcalina (pH >13) CsCl-equilibrium buoyant density gradient, il DNA leggero Ad12 e il DNA cellulare pesante etichettato con 5 BU potrebbero essere fisicamente separati.

A partire da circa 12 ore dopo l’infezione, 3L’Ad12 con etichetta H-timidina-DNA ha iniziato a spostarsi dalla posizione di densità luminosa del DNA Ad12 alla posizione del DNA cellulare pesante, e progressivamente con il tempo dopo l’infezione.

L’autenticità Ad12 del DNA spostato dalla densità è stata accertata mediante ibridazione DNA-DNA. Inoltre, il trattamento ad ultrasuoni del DNA delle cellule di criceto infette da Ad12 ha interrotto il legame alcalino-stabile (pH 13) tra il 3H-thymidine-tagged Ad12 e 5-BU heavy cellular hamster DNA.

Le 3Il DNA Ad12 con etichetta H è stato quindi spostato o vicino alla posizione di densità virale, indicando che il 3Il DNA Ad12 con etichetta H è stato rilasciato dal suo legame con il DNA cellulare pesante 5-Bu.

Questi risultati sono stati i primi a documentare l’integrazione ricombinatoria tra Ad12 e DNA a cellule di mammifero (Doerfler, 19681970).

3.3. Cosa succede nelle cellule umane infettate in modo produttivo da adenovirus?

Sono state studiate infezioni di cellule umane con adenovirus di tipo 2 (Ad2) o Ad12. Ci sono prove che il DNA dell’adenovirus umano è in grado di ricombinarsi con il DNA cellulare anche in cellule umane infettate in modo produttivo, anche se le vere integrazioni sono difficili da documentare in quanto nessuna delle cellule umane infette sopravvive alle infezioni produttive da adenovirus.

Una forma a sedimentazione rapida, pH >13 alcali-stabile del DNA virale – presunti ricombinti tra adenovirus e DNA cellulari – è stata documentata da esperimenti sequenziali di ibridazione DNA-DNA, prima di autentico DNA Ad12 seguito da ibridazione al DNA cellulare umano (Schick et al. 1976).•

Inoltre, nelle cellule umane infette da Ad12, è stato scoperto un ricombinante simmetrico naturale (SYREC) tra i 2.081 nucleotidi terminali sinistro del DNA Ad12 e un palindromo considerevole di DNA cellulare, come documentato dalle analisi della sequenza nucleotidica. 

La presenza del segnale di confezionamento dell’adenovirus nel frammento terminale di DNA Ad12 nella molecola ibrida ha facilitato l’incapsulamento in particelle virali.

Questa scoperta ha dato un supporto inequivocabile alla formazione di ricombinanti tra Ad12 e DNA cellulare anche in cellule umane infettate in modo produttivo (Deuring et al., 1981b, Deuring e Doerfler 1983).

La struttura del DNA SYREC Ad12 – molecola di DNA palindromo cellulare è servita da guida su come dovevano essere costruite molecole vettoriali di adenovirus senza intestino con carichi utili elevati.•

In altri laboratori, le prove di esperimenti di ibridazione in situ hanno dimostrato che il DNA dell’adenovirus umano persisteva nelle cellule adenoidi umane cronicamente infette (Neumann et al. 1987).

Inoltre, nelle linee cellularidi linfociti umani infettati da adenovirus latente, anche i genomi degli adenovirus persistevano (Zhang etal. 2010).

Tuttavia, in nessuno dei due sistemi è stato ulteriormente studiato lo stato molecolare dei genomi virali persistenti.

3.4. Il DNA Ad12 integrato diventa de novo Metilato cpG – correlazioni inverse tra i livelli di metilazione del DNA Ad12 e le attività genetiche dei geni virali

Nelle cellule tumorali di criceto indotte da Ad12 e nelle cellule di criceto trasformate in Ad2 o Ad12, il DNA virale integrato diventa de novo CpG-metilato in modelli specifici (Sutter et al. 1978) che tendono a diffondersi attraverso l’integrazione virale in modo specifico (Toth et al. 1989).

La dimostrazione di correlazioni inverse tra i livelli di metilazione del DNA e le attività genetiche di specifiche regioni dei genomi integrati Ad2 o Ad12 sono state tra le prime in letteratura e hanno segnato l’inizio di un impegno a lungo termine della nostra ricerca per chiarire le funzioni biologiche della metilazione del DNA CpG nelle cellule di mammifero (Sutter e Doerfler, 1980Vardimon et al. 1980Doerfler, 1983). 

Questa interrelazione inversa tra silenziamento genetico e modelli specifici di metilazione del promotore CpG è stata successivamente confermata in molti sistemi eucariotici di importanza generale.

3.5. La metilazione del promotore porta al silenziamento del promotore

In una serie di esperimenti con diversi promotori eucariotici e geni indicatori, abbiamo documentato che la metilazione specifica del promotore ha causato l’inattivazione di questi promotori (Vardimon et al. 1982Kruczek e Doerfler, 1983Langner et al. 1984).

Inoltre, specifici modelli di metilazione cpG nei genomi dei mammiferi possono essere interpretati come segnali per l’inattivazione genica a lungo termine (Doerfler, 19832006).

Una descrizione più dettagliata di questa ricerca non sarà presentata qui, perché trasgredirebbe la portata di questa revisione.

3.6. Conseguenze dell’integrazione di DNA estraneo per i genomi cellulari

È stato spesso sostenuto che l’integrazione di DNA estraneo nei genomi dell’ospite potrebbe portare alla rottura dei geni nel cromosoma ospite e quindi potrebbero insorgere mutazioni. Indubbiamente, questa è una possibilità che è stata effettivamente descritta in alcuni casi.

Tuttavia, considerando che il genoma umano trasporta l’1,1% di esoni, il 24% di introni e il 75% di DNA intergenico (Venteret al. 2001), l’integrazione di DNA estraneo ha una probabilità di circa 1/100 di colpire i geni funzionali.

Al contrario, nelle nostre analisi delle conseguenze dell’inserimento di DNA estraneo, abbiamo posto l’accento sul ruolo degli effetti epigenetici che coinvolgono siti sia vicini che lontani dal locus di integrazione (vedi sotto).

Questo aspetto delle sequele dell’integrazione del DNA estraneo è stato l’argomento di precedenti lavori del nostro laboratorio

(Heller et al, 1995Weber et a., 20152016Doerfler et al, 2018).

Nei siti di inserimento del DNA virale, il livello di metilazione del DNA CpG nel DNA cellulare adiacente è diminuito.

Quindi l’integrazione di DNA estraneo è stata in grado di alterare i segnali epigenetici del DNA cellulare in cis,immediatamente nel sito di inserimento (Lichtenberg et al. 1988).

Ma le alterazioni possono verificarsi anche in trans.

Nelle cellule di criceto trasformate in Ad12 che trasportano da 10 a 12 copie di DNA virale genomicamente integrato in un sito cromosomico [verde in Fig. 1A, evidenziato da una freccia bianca], i livelli di metilazione CpG nelle circa 900 copie di DNA retrotrasposone della particella A intracitoplasmatica cellulare (IAP) [rosa in Fig. 1A] sono stati notevolmente aumentati rispetto alle cellule di criceto non trasformate e al criceto infetto da Ad12 cellule (Fig. 1BHeller et al. 1995).

A causa dell’aumento dei livelli di metilazione del DNA CpG nelle sequenze IAP, il loro DNA si è dimostrato resistente alla scissione con endonucleasi di restrizione sensibili alla metilazione come HpaII e HhaI e non è riuscito a migrare nell’analisi di elettroforesi dei prodotti di scissione (Fig. 1B).

Le sequenze IAP sono distribuite su molti cromosomi e si trovano spesso sui loro bracci corti [segnali rosa in Fig. 1A].

Questa scoperta di un effetto transdella metilazione del DNA CpG nelle cellule di criceto transgeniche per il DNA Ad12 ci ha spinto a indagini pre-progettate sulle conseguenze delle inserzioni di DNA estraneo nelle cellule umane (vedi sotto)

È importante sottolineare che negli esperimenti descritti in Fig. 1B, l’effetto transgenomico sui profili di metilazione IAP CpG non dipendeva dalla presenza continua dei transgenomi Ad12 ma persisteva nella linea cellulare TR3, sebbene avesse perso tutti i genomi Ad12 precedentemente integrati

(Fig. 1B; Heller et al. 1995).

Quindi non si può sostenere che la mancanza di trovare genomi di adenovirus, ad esempio in cellule tumorali umane o cellule in individui con disturbi cronici, implicherebbe necessariamente che l’integrazione del DNA dell’adenovirus o quella di qualsiasi altro DNA estraneo non abbia svolto un ruolo importante nella patogenesi di queste malattie.

La persistenza del DNA transgenomico non è una precondizione necessaria per il mantenimento degli effetti trans, ad esempio qui dello stato trasformato dei genomi e delle cellule riceventi [meccanismo mordi e fuggi].

Per ulteriori indagini sugli effetti transgeneticiepigeneticinelle cellule umane transgenomiche, è stata avviata la seguente serie di esperimenti pilota.

Nelle linee clonali di cellule umane transgenomica per un plasmide batterico a 5,6 kbp, i modelli di trascrizione e metilazione CpG sono stati confrontati tra cloni cellulari transgenomici e non transgenomici utilizzando sistemi di microarray di chip genici. 

Nel 4,7% dei 28.869 segmenti genici analizzati, le attività trascrizionali erano differenzialmente aumentate o diminuite nei cloni transgenomici.

La profilazione a livello di genoma ha dimostrato la metilazione differenziale a 3791 dei > 480.000 siti CpG che sono stati esaminati in cloni cellulari transgenomici rispetto a quelli non transgenomici.

Questi dati hanno indicato che l’inserimento di DNA estraneo in un genoma umano stabilito può alterare marcatamente i profili di metilazione e trascrizione del DNA CpG cellulare. In effetti, diversi tipi di cellule sembravano essersi evoluti (Weber et al. 2015Doerfler et al. 2018).

Consideriamo questi effetti epigenetici dell’inserimento di DNA estraneo di grande importanza poiché influiscono sulla stabilità epigenetica e sulla funzione dell’intero genoma (umano).

Poiché molti approcci sperimentali in biologia e medicina ricorrono allo studio di cellule o organismi transgenomici, gli effetti epigenetici spesso insospetta sulla scia dell’inserimento di DNA estraneo dovranno essere presi in considerazione in un’interpretazione realistica dei dati sperimentali.

L’effetto trans sopra descritto sembrava essere specifico, in quanto non interessava tutte le parti del genoma umano.

I profili di metilazione nelle sequenze retrovirali umane endogene (HERV), che costituiscono circa l’8% del genoma umano, sono rimasti inalterati negli stessi cloni cellulari (Weber et al. 2016) che hanno rivelato distinti cambiamenti di metilazione in altre parti dei loro genomi (Weber et al. 2015).

I pattern di metilazione del DNA HERV in cellule transgeniche e di controllo esposte agli stessi protocolli sperimentali erano quasi identici (Weber et al. 2016).

Estendendo gli studi sul ruolo del DNA estraneo nell’ambiente, abbiamo esplorato il destino del DNA estraneo isolato che era stato somministrato ai topi di laboratorio. Il DNA estraneo ingerito dal cibo costituisce probabilmente l’incontro più abbondante e regolare di organi umani con DNA estraneo. 

Batteriofago M13 Il DNA, il gene della proteina fluorescente verde (GFP) clonata da plasmidi o il gene specifico della pianta, codificato con DNA nucleare per ribulosio-1, 5-bisfosfato carbossilasi (Rubisco) sono stati somministrati per via orale ai topi in un gran numero di esperimenti diversi.

Circa l’1% del DNA nutrito è sopravvissuto al passaggio attraverso il tratto gastro-intestinale murino in forma frammentata e potrebbe essere rintracciato in quantità ancora inferiori a diversi sistemi di organi, in particolare la milza e il fegato degli animali.

In un esperimento, si potrebbero addotte prove che il DNA del test recuperato dalle cellule della milza era collegato a un segmento di DNA di 80 nt con omologia del 70% al gene del recettore IgE del topo (Schubbert et al. 1997).

La linea germinale dei topi sembrava essere protetta dall’invasione del DNA ingerito dal cibo [ (Hohlweg e Doerfler, 2001)].

Quindi sembra probabile che l’esposizione al DNA ingerito dal cibo sia una sfida continua per la stabilità del genoma nelle cellule stocasticamente coinvolte dell’organismo dei mammiferi.

Non abbiamo informazioni su questo problema negli esseri umani.

3.7. Integrazione del DNA vettore dell’adenovirus

Il laboratorio di Stefan Kochanek presso l’Università di Ulm in Germania ha condotto uno studio pilota per indagare se il DNA vettore dell’adenovirus potrebbe diventare cromosomicamente integrato sulla scia del trasferimento genico mediato da vettori di adenovirus nei topi [Stephen et al. 2010].

Vettori di adenovirus carenti di replicazione che trasportano diversi transgeni sono stati iniettati per via endovenosa nei topi.

Nel transgene che esprime epatociti sono stati trovati costrutti vettoriali integrati nel genoma del topo.

Le analisi dei siti di giunzione tra DNA vettoriale e cellulare hanno rivelato un legame covalente del vettore termini al DNA cellulare di topo mediante ricombinazione eterologa ad una frequenza di 6,7 × 10−5 epatociti trasdotti. I ricombinanti omologhi sono stati identificati a frequenze cento volte più basse (Stephen et al. 2010).

Nella loro valutazione di questi risultati gli autori hanno suggerito che la frequenza della ricombinazione del DNA del vettore adenovirale eterologo con il genoma ricevente era paragonabile a quella delle mutazioni spontanee nelle cellule di mammifero.

Naturalmente, è una domanda aperta quali fattori suscitano “mutazioni spontanee”.

Tra le altre cause, la ricombinazione del DNA umano con DNA estraneo potrebbe svolgere un ruolo importante nella generazione di mutazioni spontanee.

Infine, la quantità di DNA vettore di adenovirus confezionato con virione che viene regolarmente somministrato per via intramuscolare, ad esempio con il vaccino AstraZeneca (50×109 virioni per dose di vaccino, equivalente a circa 2,5μg di DNA vettore di adenovirus per dose), è inferiore a quello in molti regimi di terapia genica.

Per informazioni dettagliate, vedere

[https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/963928/UKPAR_COVID_19_Vaccine_AstraZeneca_23.02.2021.pdf].

3.8. SARS-CoV-2 RNA trascritto inverso e integrato nel genoma?

Motivati da rapporti sulla prolungata perdita di RNA SARS-CoV-2 e sui continui test RT-PCR positivi tra i sopravvissuti al Covid-19, Zhang et al. hanno studiato se l’RNA SARS-CoV-2 potesse essere trascritto inversamente nel DNA che a sua volta potrebbe integrarsi nel genoma dell’ospite e continuare a essere trascritto in RNA (Zhang et al., 2021).

Con analisi di sequenze nucleotidiche, gli autori hanno osservato copie del DNA SARS-CoV-2 nei genomi di circa il 10-20% dei pazienti Covid-19. Questo DNA SARS-CoV-2 è stato affiancato da duplicazioni del sito bersaglio e sequenze di riconoscimento dell’endonucleasi LINE-1 di consenso. Le ultime due caratteristiche non sono state sempre osservate.

Quindi erano concepibili anche meccanismi line-1 indipendenti per l’integrazione del DNA SARS-CoV-2. È stato sottolineato che solo le parti sub-genomiche del DNA SARS-CoV-2 sono state trovate integrate.

Questo tipo di integrazione preclude la possibilità che il virus infettivo venga prodotto da coloro che trasportano DNA virale frammentato SARS-CoV-2. Le parti integrate del DNA sars-CoV-2 sono state spesso trascritte.

Gli autori hanno concluso che l’infezione da SARS-CoV-2 potrebbe portare alla sintesi di trascrittasi inverse endogene LINE-1 con codifica retrotrasposone. Questi enzimi hanno generato retro-trascrizioni del DNA.

Forse solo frammenti di questo DNA sono stati inseriti nei genomi umani e trascritti in SARS-CoV-2 RNA.

Questa scoperta potrebbe avere implicazioni nel contesto delle sequele a lungo termine delle infezioni da SARS-CoV-2 per i genomi dei pazienti Covid-19. Inoltre, i vaccini a base di RNA impiegati con successo in tutto il mondo dovranno essere esaminati anche in questo senso.

Risultati inaspettati come quelli qui descritti dovranno essere riprodotti da altri. Probabilmente, i risultati qui descritti stimoleranno indagini su meccanismi simili che influenzano ulteriori patogeni virali dell’RNA (Zhang et al., 2021).

3.9. Osservazioni sul vettore di adenovirus dello scimpanzé utilizzato nel vaccino AstraZeneca SARS-CoV-2 ChAdOx1

I dettagli sulla struttura e la trascrizione della spina dorsale virale del vettore adenovirus dello scimpanzé che è stato utilizzato nella progettazione del vaccino AstraZeneca SARS-CoV-2 ChAdOx1, sono stati recentemente pubblicati.

(Almuqrin et al. 2021)

In questo vettore, una parte non specificata della regione E1 del genoma adenovirale è stata sostituita dalla sequenza codificante della proteina spike SARS-CoV-2. Quindi il costrutto vettoriale è difettoso di replica.

L’espressione della glicoproteina spike SARS-CoV-2 nel costrutto vettoriale è stata postulata sotto il controllo del promotore Tet-responsive CMV [citomegalovirus] (Loew et al. 2010), uno dei forti promotori eucariotici.

Il vettore, tuttavia, inoltre trasporta ancora 28 kbp in particolare dei geni dell’adenovirus dello scimpanzé tardivo (Almuqrin et al. 2021).

La loro attività trascrizionale potrebbe essere ancora sotto il controllo remoto di segmenti della regione E1 che potrebbero essere rimasti nel costrutto.

A seconda della linea cellulare umana che è stata infettata dal vettore, sono stati trovati geni della spina dorsale virale adenovirale espressi a diversi livelli. Attualmente non è noto quali geni dell’adenovirus dello scimpanzé siano effettivamente espressi nei vaccinati umani e come i profili di espressione adenovirale varino tra i diversi destinatari del vaccino.

Finora, il contributo causale dei prodotti del gene tardivo adenovirale agli effetti collaterali del vaccino che sono stati osservati in tutto il mondo, non è stato studiato e non può essere escluso.

Quindi, oltre ai possibili problemi a lungo termine derivanti dall’uso di vettori adenovirali a causa della loro integrazione e sequele epigenetiche (vedi sopra), i vettori di adenovirus rimangono problematici poiché esprimono ancora prodotti genici virali (Almuqrin et al. 2021) il cui ruolo nel suscitare effetti collaterali pericolosi nei vaccinati umani non è stato valutato criticamente.

Non sono state presentate informazioni sull’estensione e la natura dell’espressione genica adenovirale di ChAdOx1 nei vaccinati umani. In assenza delle funzioni trans-attivanti della regione ChAdOx1 E1, i transattivatori cellulari negli organismi vaccinati potrebbero facilitare l’espressione dei geni virali ChAdOx1 tardivi.

Le omologie di breve sequenza in questi geni ChAdOx1 ai geni dell’adenovirus umano potrebbero essere sufficienti per suscitare risposte immunitarie di memoria nei vaccinati con forza individualmente diversa.

Quest’ultimo potrebbe essere accentuato nei giovani che sono ancora più vicini alle loro esperienze infantili con infezioni adenoviraliumane .

Le giovani donne che forniscono la maggior parte dell’assistenza ai pazienti e agli anziani nella società potrebbero quindi essere influenzate preferenzialmente da queste reazioni immunologiche eccessive, quindi questi vaccinati potrebbero essere più frequentemente colpiti da reazioni avverse alla vaccinazione. 

Perché i trombociti sarebbero specificamente presi di mira da questo tipo di risposte immunitarie di memoria rimane da indagare.

In questo contesto, sarà obbligatorio ricordare che la trombocitopenia è stata riscontrata anche in riceventi di costrutti vettoriali di adenovirus nel corso di applicazioni terapeutiche geniche (Lopez-Gordo et al, 2017).

I ricercatori che lavorano sui vettori adenovirali sono stati a conoscenza dell’incidente di Jesse Gelsinger nel 1999 [https://en.wikipedia.org/wiki/Jesse_Gelsinger].

A quel tempo, un maschio di 18 anni che soffriva di una malattia metabolica genetica legata all’X, il deficit di ornitina transcarbamilasi del fegato, fu il primo destinatario di un regime terapeutico genico basato su vettori adenovirali e morì pochi giorni dopo l’applicazione dell’adenovirus ricombinante.

I possibili fattori coinvolti nell’esito fatale sono stati studiati all’epoca, ma non hanno potuto essere chiaramente identificati. L’incidente ha interrotto l’uso di vettori di adenovirus nella terapia genica per lungo tempo.

Molto recentemente, un’indagine dettagliata, apparentemente continua, di questo incidente fatale lo ha attribuito alla generazione di complessi adenovirus-anticorpo che hanno contribuito a “infiammazione sistemica letale” nell’organismo del ricevente (Somanathan et al. 2020).

Naturalmente, il vettore dell’adenovirus umano di tipo 5 (Ad5) che è stato impiegato nella misura terapeutica genica del 1999 non può essere confrontato direttamente con il vettore di adenovirus dello scimpanzé utilizzato nel vaccino SARS-CoV-2 nel 2021.

I vettori derivati dall’Ad5 fanno, tuttavia, parte di altri vaccini SARS-CoV-2.

Quindi si deve comunque osservare estrema cautela quando si iniettano vettori adenovirali nell’uomo.

Speriamo che le esperienze catastrofiche del passato non riemergano con i vettori di oggi che, tuttavia, non sono poi così diversi da quelli problematici più vecchi.

A lungo termine e dopo una considerazione più attenta, i vaccini convenzionali basati sulla proteina spike ricombinante avrebbero potuto essere una scelta più sicura.

4. Conclusioni

La vita si è sviluppata in un mondo di DNA, molto probabilmente preceduto da un RNA. Viviamo tutti in questo mondo del DNA a partire dai nostri cortili quando scaviamo la terra con innumerevoli microrganismi e il loro DNA sepolto in detriti secolari di resti animali e vegetali in decomposizione.

Basta considerare il fogliame annualmente versato. Con il nostro approvvigionamento alimentare quotidiano assumiamo DNA estraneo in enormi quantità che non viene momentaneamente digerito in mononucleotidi ma persiste transitoriamente sotto forma di frammenti che sono in grado di entrare nell’organismo umano e distribuirsi in diversi sistemi di organi umani.

Il DNA è una molecola molto stabile. In minuscole schegge ossee di individui della popolazione di Neanderthal di ~ 50.000 anni fa, frammenti di DNA di Neanderthal sono persistiti fino ad oggi.

Nei campioni ossei scavati dai Neanderthal, che Svante Pääbo e i suoi colleghi hanno studiato, il DNA di Neanderthal rappresentava solo circa lo 0,5% del DNA dei campioni ossei analizzati ( Prüfer et al. 2017).

Quando si è presentata l’occasione, il DNA estraneo e la sua capacità di sopravvivere e ricombinarsi con il DNA di organismi viventi, potrebbe aver svolto un ruolo importante nell’evoluzione.

Mentre stiamo lottando con la pandemia di Covid-19 sul pianeta Terra, il rover Perseverance sta scavando alla ricerca di tracce di decadimento organico sul pianeta Marte.

Questa breve rassegna è stata presentata qui per facilitare una discussione indipendente e più equilibrata sui potenziali rischi dovuti alla presenza di DNA vettore di adenovirus (AstraZeneca, Johnson & Johnson, Sputnik V e altri) o SARS-CoV-2 RNA (BioNTech / Pfizer, Moderna) nei vaccini che dovrebbero proteggere dal Covid-19.

Naturalmente, le iniezioni di vaccini basati su vettori nel muscolo deltoide umano sono una questione diversa rispetto ai rari eventi casuali che portano a eventi di ricombinazione tra DNA estranei e umani nei sistemi sperimentali come descritto sopra. Inoltre, né il tipo né la frequenza delle conseguenze di rari eventi di integrazione vettoriale possono essere valutati realisticamente al momento.

Al contrario, i risultati recentemente pubblicati sui benefici della protezione contro Covid-19 offerti dai vaccini BioNTech / Pfizer sono incoraggianti (Dagan et al. 2021).

Certo, la giuria è ancora fuori fino a che punto uno qualsiasi dei vaccini proteggerà dalle nuove varianti più pericolose di SARS-CoV-2 provenienti da Regno Unito, Sud Africa, Brasile, India (ora denominate rispettivamente α, β, γ, δ) o da varianti sconosciute che potrebbero sorgere in futuro dati i livelli scarsamente controllati di replicazione virale in tutto il mondo(Weber et al., 2021).

Infine, siamo ignoranti sulla protezione vaccinale contro lo sviluppo di sintomi prolungati e ad esordio tardivo di Covid-19.

Le informazioni presentate in questa revisione aiuteranno i futuri vaccinati a valutare una valutazione del rischio rispetto al beneficio, vale a dire gli eventi di integrazione del vettore adenovirus o del DNA del trascritto inverso dell’RNA SARS-CoV-2 a bassa frequenza rispetto all’efficacia e alla protezione del vaccino, si spera elevata.

Inoltre, poiché l’infezione da SARS-CoV-2 da sola può essere associata all’integrazione di trascrizioni inverse dell’RNA virale (Zhang et al., 2021), questa serie di eventi potrebbe diventare inevitabile in qualsiasi infezione da SARS-CoV-2. Infine, la misura in cui i prodotti genici adenovirali potrebbero diventare co-espressi con la glicoproteina spike SARS-CoV-2 dopo l’iniezione di vaccino vettore nei muscoli deltoidi umani rimane non studiata.

Al momento non possiamo valutare i loro possibili effetti sull’organismo umano, se effettivamente espressi.

Opportunità e rischi, entrambi allo stesso tempo, rimangono al di là delle nostre aspettative di controlli assoluti perché la vita e l’evoluzione probabilmente sono state influenzate da “meccanismi di casualità” fin dall’inizio.

Le osservazioni cliniche sui risultati positivi di lunga durata del test RT-PCR che implicano l’integrazione del DNA SARS-CoV-2 nel genoma umano nel corso di alcuni casi di Covid-19, rendono irrealistiche le apprensioni sugli eventi di integrazione associati al vaccino, rispetto ai benefici sperati dalla vaccinazione contro Covid-19.

La popolazione umana del 2021 affronta una crisi biomedica di dimensioni, negli ultimi tempi, senza precedenti e dovrà accettare le migliori contromisure attualmente disponibili contro il Covid-19 – Vaccinazione.

4.1. Nota aggiunta in revisione

Al culmine di una pandemia senza precedenti, il rapido sviluppo di vaccini SARS-CoV-2 efficienti è stato accolto con sollievo e ammirazione per la scienza sperimentale. (Sahin et al., 2021).

Tuttavia, si dimostrerà convincente dal punto di vista medico considerare possibili sequele di iniezioni di vaccino in miliardi di esseri umani. Una dose da 0,5 ml di adenovirus ricombinante ChAdOx1-S di AstraZeneca contiene 5 × 1010 particelle di adenovirus scimpanzé 26 (Ad26)

https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/963928/UKPAR_COVID_19_Vaccine_AstraZeneca_23.02.2021.pdf

che trasportano un equivalente di circa 2,5μg di DNA di scimpanzé ricombinante Ad26. Le particelle di adenovirus sono probabilmente assorbite dalle cellule del sistema linfatico e del fegato e il loro DNA sarà trasportato ai nuclei delle cellule.

In questa revisione, sono state presentate le prove per l’inserimento del DNA dell’adenovirus nei genomi dei riceventi e le sue conseguenze. (I)

I vaccini basati su vettori di adenovirus possono portare all’integrazione del DNA dell’adenovirus con frequenza sconosciuta e con conseguenze epigenetiche imprevedibili. È concepibile che gli effetti epigenetici possano essere notati solo anni dopo la vaccinazione. (II)

I geni adenovirali ancora presenti nel DNA vettore dell’adenovirus potrebbero essere trans-attivati da fattori cellulari e portare a reazioni di memoria immunitaria variabili individualmente che vengono sperimentati dai vaccinati come sintomi transitori post-vaccinazione.

Gli esiti fatali dovuti a reazioni immunitarie estreme sono stati fortunatamente eventi molto rari. (III)

L’RNA SARS-CoV-2 o segmenti di esso, come il gene spike, possono essere trascritti inversamente da trascrittasi inverse codificate LINE-1 o altri fattori, e il DNA così sintetizzato può essere integrato a frequenze e posizioni sconosciute nei genomi dei vaccinati. 

Naturalmente, lo stesso vale per tutte le infezioni da SARS-CoV-2. Pertanto, il rischio di eventi indesiderati di integrazione dei trascritti inversi dell’RNA SARS-CoV-2 sulle infezioni da SARS-CoV-2 appare simile a quello al momento della vaccinazione con il vaccino Covid-19 a base di mRNA.

Questi meccanismi della biologia di base devono essere considerati nel contesto dei programmi di vaccinazione di massa degli esseri umani in tutto il mondo. Se e come questi meccanismi svolgeranno un ruolo predominante in medicina in futuro dovranno essere seguiti da meta-analisi critiche.

Al momento non esiste un’alternativa praticabile alla vaccinazione di miliardi di esseri umani. La popolazione umana attualmente partecipa all’esposizione al DNA estraneo in un enorme esperimento.

Dopo il completamento delle vaccinazioni in tutto il mondo, dovrebbe essere istituito un programma di sentinella post-vaccinazione per monitorare l’esacerbazione di disturbi umani inaspettati, possibilmente nuovi, in individui vaccinati.

Dichiarazione dei conflitti d’interesse

L’autore dichiara di non essere in conflitto d’interesse

Riconoscimenti

I thank Rudolf Jaenisch, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA, for making their manuscript Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2021, online, available to me prior to publication.

At different times, research in W.D.’s laboratory has been supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft in Bonn-Bad Godesberg (SFB 74 and SFB 274), by the Center for Molecular Medicine Cologne (CMMC, TP13), by the Thyssen Foundation in Cologne (Az. 10.07.2.138 plus a stipend to A. Naumann Az. 40.12.0.029.), by the Staedtler Stiftung in Nürnberg (WW/eh 01/15), by the Dr. Robert Pfleger Stiftung in Bamberg and by the continued support of W.D.’s Epigenetics Group at the Institute for Clinical and Molecular Virology, Friedrich-Alexander University, Erlangen-Nürnberg.

Our very recent SARS-CoV-2 mutant analyses (Weber et al. 20202021), have in part been supported by the Dr. Robert Pfleger Stiftung.

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© 2021 L’Autore. Pubblicato da Elsevier B.V.